新型冠状病毒研究与候选药物筛选

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晶泰科技 2020-02-02

        新型冠状病毒(2019-nCoV)与SARSMERS 同属于β类冠状病毒,目前尚无针对性的治疗方案。在控制疫情发展的同时,如何讯速理解病毒感染机理,尽快找到有效的治疗药物,是一场争分夺秒的赛跑。作为药物研发社群的一份子,我们责无旁贷。希望能以晶泰科技计算之所长,通过分享我们完成的大量计算数据与成果,助力实验的加速进展,为尽早开发出新型冠状病毒的有效药物贡献一份力量。

                          

        疫情出现后,晶泰科技于120日迅速成立研究小组,调集云端的巨大算力,对病毒感染宿主机理提供分子层面的研究,为病毒预警和防治、药物开发提供底层基础研究和数据开源支持。研究小组基于基因序列相似性最高的SARS-Cov病毒对2019-nCoV病毒进行同源建模,并结合高精度分子动力学计算与药物分子模拟研发平台,先后获得2019-nCoV 病毒上3CLproPLpro两个潜在靶点以及与传染相关的Spike蛋白的三维结构。通过计算出Spike蛋白与ACE2配体的结合自由能和、构象,发现2019-nCoV病毒与人体ACE2蛋白的亲和力可能略高于SARS,在一定程度上预测验证了病毒较大的人际传播可能性。研究小组还利用高精度的自由能微扰(XFEP)方法,对结合位点的蛋白质重要残基进行了分析和丙氨酸扫描,从而预测病毒及其突变对传染性和致病性的影响,为提前开发相应的多肽或抗体类药物、快速对突变毒株做出响应打下基础。

        

        截至目前,晶泰科技利用2019-nCoV病毒的几个关键蛋白的三维结构模型,已完成针对全球已上市药物小分子及重要分子的老药新用筛选,找到183个对病毒有潜在治疗效果的药物,并给出活性排序。研发小组目前正针对Remdesivir (GS-5734)等高关注度药物完成活性重点分析。晶泰科技也在积极与武汉的实验科研组建立细胞层面试验数据的信息通路,同时寻找合作进行动物实验,用于进一步确认小分子单药和联合用药治疗效果。

 

        晶泰科技现将阶段性研究成果与计算数据与同行共享,希望我们的工作能为战斗在抗击疫情一线的科学家和医务工作者们提供帮助,加快找到有效药物的进程,为疫苗研发与临床治疗提供科学参考与研究基础。希望有实验验证能力及合作意愿的企业和研究团队与我们联系,协力同心,攻坚克难,共同加速2019-nCoV的治疗药物研发。

         

1.    3CLproPLpro 潜在靶点的三维结构

 

图1: SARS和MERS的基因组和蛋白,以及病毒结构的示意图【文献1】

 

        新型冠状病毒(2019-nCoV)与非典型性肺炎(SARS-CoV)和中东呼吸综合征(MERS-CoV)同源,都属于β类冠状病毒。在冠状病毒的非结构蛋白中(图1),3CLproPLproSARS-CoVMERS-CoV的良好靶点,通过抑制其水解活性可以抑制冠状病毒的转录和翻译过程,从而抑制病毒传播、达到治疗效果【文献13】。因此,3CLproPLpro也是治疗2019-nCoV的潜在靶点。

        

        晶泰科技基于120NCBI披露的2019-nCoV基因序列进行序列比对,发现其与SARS-CoV的基因序列最为相似,同源性高达79.5%。遂即通过同源建模,根据SARS-CoV的蛋白晶体结构获得2019-nCoV3CLproPLpro的三维结构,并对获得的三维结构进行确认,对结合位点的氨基酸残基进行全面分析。我们将同源建模所获得的2019-nCoV-3CLpro结构与126上海科技大学和中科院上海药物所解析出来的晶体结构(PDB ID6LU7,【资料1】)进行了叠合比较,二者的RMSD1.23Å

 

图2 2019-nCoV的3CLpro结构对比:同源建模(绿色)与晶体结构(6LU7,粉色)

下载3CLpro同源建模的模型结构
下载PLpro同源建模的模型结构

        

2.    老药新用筛选

               

        基于3CLproPLpro同源建模获得的三维结构,晶泰科技在其新药虚拟筛选平台上,对2900多个FDA已获批药物分子和超过10000个中药成分分子进行了活性筛选,共得到183个对3CLproPLpro靶点有潜在抑制作用的候选分子,并对他们的活性进行预测排序。其中,有针对2019-nCoV-3CLpr的上市药41个,中药成分分子41个;针对2019-nCoV-PLpro的上市药55个,中药成分分子46个。这一候选药物表单与近期公布的、包括中科院上海药物所预测的老药分子有所重合。目前,晶泰科技正在运用更高精度的MMGBSA计算获得更精确的活性排位。

 

图3:对3CLpro靶点可能有抑制作用的活性排序靠前的已上市药物分子。其中,Carfilzomib和Saquinavir在出现在【文献8】中科院上海药物所和上海科技大学联合研究团队发现的潜在药物列表。

 

        出于科学严谨性,暂仅对科研同行公开这一列表。欢迎具备病毒及分子层面快速实验验证能力的企业和研发机构与我们联系,共同加速有效治疗药物的筛选。

获取老药新用活性预测表单及实验合作对接,请发邮件至ncov@xtalpi.com

 

3. Spike蛋白结合构象及亲和力研究

 

        引起此次武汉肺炎疫情的新型冠状病毒2019-nCoV表面的S蛋白(Spike Glycoprotein, 刺突糖蛋白)在病毒感染中负责结合宿主受体细胞,并促进病毒与细胞膜的融合,是小分子、多肽药物开发的潜在靶点。最新研究显示,S蛋白在人体中结合的受体蛋白很可能是ACE2蛋白(Angiotensin-Converting Enzyme 2, 受体血管紧张素转化酶2)【文献4】。

 

        我们对新型冠状病毒S蛋白S1亚基的受体结合区( Receptor Binding DomainRBD) ACE2受体所形成的蛋白复合物进行了同源建模和分子动力学模拟,预测了S蛋白的RBD在结合ACE2以后可能发生的构象变化;在此基础上,采用晶泰科技的XFEP高精度自由能微扰(Free Energy Perturbation, FEP)方法,对受体结合区的关键氨基酸进行丙氨酸扫描 (Alanine Scan),进而得到S蛋白可能的突变对病毒入侵人体细胞过程产生的影响。

 

  • 新型冠状病毒S蛋白同源建模

        以SARS病毒S蛋白在结合状态下的RBD区域作为模版(PDB ID: 2AJF,【文献5】),我们通过同源建模得到了新型冠状病毒2019-nCoV S蛋白与ACE2结合的模型。分析结果表明, 2019-nCoVSARS-CovRBD区域的氨基酸序列一致性为72.8%。相比之下,2019-nCoV 跟引起中东呼吸综合症的MERS病毒MERS-CoV以及人冠状病毒HCoV-229E在受体结合区域的序列相似性则显著偏低,分别为17.4%35.8%

图4:通过同源建模得到的2019-nCoV S蛋白与受体ACE2蛋白的结合模式。其中粉色的是2019-nCoV S蛋白,绿色的是ACE2,蓝色的是两个蛋白中有相互作用的残基。

 

  • S蛋白RBD-ACE2复合物结构探索与构象优化 

        我们对2019-nCoV RBDACE2的复合物进行了100 纳秒的分子动力学模拟,在平衡后的动力学模拟过程中, 未对受体和病毒蛋白质的坐标进行任何约束。

 

图5及视频:2019-nCoV Spike 蛋白RBD和ACE2的复合物100纳秒的分子动力学模拟

        同时,我们用MMGBSA方法计算得到了S蛋白与人类ACE2的结合自由能,并获得了重要残基的能量贡献,计算结果与蛋白质建模软件根据MD所算出的结果相互验证。目前,我们正在积极联系实验机构购买蛋白,对这一结果进行验证。在得到2019-nCovACE2复合物的蛋白晶体结构后,可对其结合力进行精度更高的计算。

        通过对分子动力学的轨迹进行观察发现,复合物的结构在模拟的过程中始终维持相对稳定,并在结合界面处形成了大量的氢键结构和疏水相互作用。初始的复合物的结构和轨迹最后一帧的坐标之间的RMSD为1.89 Å

 

6:复合物2019-nCoV RBD-ACE2 的初始结构(粉色、蓝色)和100 纳秒分子动力学模拟轨迹的最后一帧(橙色)结构的叠合。

 

        在以同源模型作为初始结构的动力学模拟中,2019-nCoV病毒和SARS病毒在受体结合区域的氨基酸序列差异并没有导致受体和配体蛋白的分离;在力场的作用下,2019-nCoV病毒RBD-ACE2复合物通过长时间的动力学模拟,逐步优化为更合理的结构。

下载S蛋白的同源建模模型结构
下载S蛋白MD优化后的模型结构

         

4. 基于XFEP方法的丙氨基酸扫描         

        冠状病毒通过S蛋白S1亚基上的RBDACE2受体结合来感染人体细胞,因此通过计算S蛋白不同突变体与ACE2的结合力变化,可以在一定程度上预测病毒突变体的传染性和致病性变化。我们在动力学模拟产生的构象基础上,进一步采用高精度的自由能微扰方法,对2019-nCoV RBD区域的关键氨基酸残基进行了丙氨酸扫描。计算和观察发现,2019-nCoV病毒在受体结合界面上相对于SARS多处残基类型的变化,有可能增强病毒的结合能力。

        

        例如,SARS-CoV RBD区域的第487号残基苏氨酸(Thr)是稳定SARS病毒与受体结合的一个关键的位点【文献6】。在SARS-CoV中,Thr487的甲基官能团指向ACE2结合界面上Lys353Asp38形成的盐桥,起到稳定盐桥和结合界面的作用 (7a)XFEP的计算结果显示,把此氨基酸位点突变成丙氨酸后损失的结合自由能的数值约为1.1 kcal/mol。而在2019-n CoV中,Thr487的位置被天冬酰胺(Asn)所取代后,该位点对RBD片段亲和力的贡献反而显著提升,突变为丙氨酸(Ala)后将损失4.3 kcal/mol的结合自由能 。原因可能是Thr487位点上天冬酰胺的取代依然保留了对盐桥Lys353-Asp38的支撑,还与ACE2Tyr41形成氢键,因而增强了复合物的亲和力和位点周围结构的稳定性(7b)

7:第487号氨基酸 附近相互作用的比较: (a) SARS-CoV RBD 的晶体结构 (b) 复合物2019-n CoV RBD-ACE2经模拟优化后的构象。

 

        另外一个例子是由SARS-CoV RBD 片段的第442号残基酪氨酸(Tyr)和第479号的Asn所共同引起的局部相互作用的变化。在2019-n CoV中,这两个残基位点分别被亮氨酸(Leu)和谷氨酰胺(Gln)所取代【图 8】。在SARS-CoV RBDACE2的结合界面上,Asn479被保护在附近的Tyr442Tyr440形成的一个小的疏水口袋里,而对面的ACE2受体蛋白上的Lys31Glu35通过电荷相互作用形成了盐桥的结构【图 8a】。而在2019-nCoV RBD-ACE2, 替代Asn原有位置的Gln从疏水口袋中伸出,干扰了Lys31Glu35之间的静电作用,并在整体构象调整的基础上,和两者分别形成了氢键相互作用【图 8b】。XFEP的扫描结果显示,N479QY442L这两处突变均起到了稳定结合界面的作用:将442Tyr479Asn突变为Ala损失的结合自由能的数值分别为1.10.8 kcal/mol, 而将LeuGln突变为Ala损失的结合自由能则更多,分别为3.91.3 kcal/mol

8:第442和479号氨基酸 附近相互作用的比较: (a) SARS-CoV RBD 的晶体结构 (b) 复合物2019-n CoV RBD-ACE2经模拟优化后的构象。

 

        当然,要判断新型冠状病毒与受体整体的结合能力,需要综合考虑结合界面上所有重要残基的贡献才能下结论。2019-nCoV属于RNA病毒,传播时S蛋白会较快发生突变【资料2】。如果能够提前获知哪些氨基酸的突变可以增强病毒的传染性,就可以提前开发相应的多肽或抗体类药物,快速对突变毒株做出响应,减少潜在的风险和损失。使用高精度的计算方法,可以准确评价氨基酸突变给病毒结合受体的能力带来的影响,并由此预测病毒的基因序列突变可能会给病毒传播能力带来的变化。

 

        最后,感谢晶泰科技新冠状病毒研究小组的各位同事,在第一时间投入紧张的研发工作中,春节假期也不曾松懈。我们也要感谢坚守岗位的医务人员,感谢同样笔耕不辍、及时发布研究成果的科研同行,和所有在以自己的方式为抗击肺炎疫情贡献力量的人们。新型冠状病毒的创新疗法研发仍然任重而道远,但是绝不孤单。

  

参考文献:

  1. Zumla, A., Chan, J. F. W., Azhar, E. I., et al. (2016) Coronaviruses -drug discovery and therapeutic options. Rev. Drug Discov. 1, 327.
  2. Kumar, V., Jung, Y.-S. and Liang, P.-H. (2013) Anti-SARS coronavirus agents: a patent review (2008 – present), Expert Opin. Ther. Pat. 10, 1337-1348.
  3. Zhou, P., Yang, X. L., Wang, X. G., et al. (2020) Discovery of a novel coronavirus associated with the recent pneumonia outbreak in humans and its potential bat origin. bioRxiv.
  4. Xu, X., Chen, P., Wang, J., Feng, J., Zhou, H., Li, X., Zhong, W. and Hao, P. (2020) Evolution of the novel coronavirus from the ongoing Wuhan outbreak and modeling of its spike protein for risk of human transmission. Sci China Life Sci
  5. Li, F., Li, W., Farzan, M. and Harrison, S. (2005) Structure of SARS coronavirus spike receptor-binding domain complexed with receptor. Science 309, 1864-1868.

其他资料来源:

  1. 上科大和上海药物所联合研究团队预先公布新型肺炎冠状病毒3CL水解酶高分辨率晶体结构, 来源: http://siais.shanghaitech.edu.cn/2020/0126/c5404a50144/page.htm
  2. 已经出现了含有S蛋白突变的变异毒株,突变氨基酸为F32I,数据来源:https://nextstrain.org/ncov

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